Ex vivo что это такое

Ex vivo что это такое

Видео: 1.1. Качество генной терапии: справочные и регуляторные вопросы

Содержание

Ключевое различие — генная терапия Ex vivo и in vivo

Генная терапия — важный метод, который используется для лечения или профилактики генетических заболеваний путем введения генов для отсутствующих или дефектных генов. Определенные заболевания можно вылечить, вставив здоровые гены вместо мутировавших или отсутствующих генов, ответственных за заболевание. Генная терапия в основном применяется для соматических клеток, чем для клеток зародышевой линии, и ее можно разделить на два основных типа: генная терапия Ex vivo и генная терапия In vivo. Ключевое различие между генной терапией Ex vivo и In vivo заключается в том, что терапевтические гены передаются in vitro клеточные культуры и повторно введены пациенту в генной терапии ex vivo пока гены доставляются непосредственно в ткани или клетки пациента без культивирования клеток in vitro в генной терапии in vivo.

СОДЕРЖАНИЕ
1. Обзор и основные отличия
2. Что такое генная терапия Ex vivo
3. Что такое генная терапия in vivo
4. Параллельное сравнение — генная терапия Ex vivo и in vivo
5. Резюме

Что такое генная терапия Ex vivo?

Генная терапия ex vivo — это тип генной терапии, который включает внешнюю модификацию клетки пациента и повторное введение ее пациенту. Клетки культивируются в лабораториях (вне тела пациента), и в них вставляются гены. Затем отбирают стабильные трансформанты и повторно вводят пациенту для лечения заболевания. Генная терапия ex vivo может применяться только к определенным типам клеток или выбранным тканям. Клетки костного мозга — это клетки, часто используемые для генной терапии ex vivo.

Процедура генной терапии Ex vivo

Генная терапия Ex vivo включает несколько основных этапов:

1. Клетки с дефектными генами изолированы от пациента.
2. Изолированные клетки выращивают в культурах в лаборатории.
3. Терапевтические гены вставляют или вводят в выращенные культуры клеток с использованием векторов.
4. Трансформированные клетки отбирают из нетрансформантов и выращивают.
5. Выбранные клетки трансплантируются пациенту.

В генной терапии ex vivo носители или векторы используются для доставки генов в клетки-мишени. Успешная доставка гена зависит от системы-носителя, и важными векторами, используемыми в генной терапии ex vivo, являются вирусы, клетки костного мозга, искусственная хромосома человека и т. Д. По сравнению с генной терапией in vivo генная терапия ex vivo не связана с неблагоприятными иммунологическими факторами. реакции в организме пациента после проведения генетической коррекции in vitro. Однако успех зависит от стабильного включения и экспрессии лечебного гена в организме пациента.

Что такое генная терапия in vivo?

Генная терапия in vivo — это метод, который включает прямую доставку генов в клетки конкретной ткани внутри тела пациента для лечения генетических заболеваний. Его можно наносить на многие ткани человеческого тела, включая печень, мышцы, кожу, легкие, селезенку, мозг, клетки крови и т. Д. Терапевтические гены вводятся пациенту вирусными или невирусными векторами.Однако успех зависит от нескольких факторов, таких как эффективное поглощение векторов, несущих терапевтический ген, клетками-мишенями, внутриклеточная деградация генов в клетках-мишенях и поглощение гена ядром, способность гена к экспрессии и т. Д.

В чем разница между генной терапией Ex vivo и in vivo?

Ex vivo против генной терапии in vivo

Резюме — Ex vivo против генной терапии in vivo

Терапевтические гены вводятся в организм пациента для лечения некоторых заболеваний. Он известен как генная терапия и может осуществляться двумя способами, а именно генной терапией ex vivo и генной терапией in vivo. Разница между генной терапией ex vivo и in vivo заключается в том, что генная терапия in vivo вводится в клеточные культуры вне тела пациента, и исправленные клетки повторно вводятся пациенту, в то время как in vivo гены генной терапии вводятся непосредственно в внутренние ткани-мишени без изоляции клеток. Успех обоих процессов зависит от стабильного внедрения и трансформации терапевтических генов в клетки пациента.

Ссылка:
1. «Что такое генная терапия? — Домашний справочник по генетике ». Национальная медицинская библиотека США. Национальные институты здоровья, без даты. Интернет. 24 апреля 2017.
2. ”Оценка клинического успеха генной терапии ex vivo и in vivo | JYI — Журнал исследований для студентов ». JYI Журнал исследований для студентов. N.p., n.d. Интернет. 24 апреля 2017
3. Кристал, Рональд Г. «Стратегии генной терапии in vivo и ex vivo для лечения опухолей с использованием векторов переноса генов аденовируса». SpringerLink. Springer-Verlag, n.d. Интернет. 24 апреля 2017

Изображение предоставлено:
1. «ExVivoGeneTherapy pl» Автор Pisum na podstawie pracy Lizanne Koch — собственная работа (CC BY-SA 3.0) через Commons Wikimedia
2. «Генная терапия in vivo pl» Автор Pisum na podstawie pracy Lizanne Koch — собственная работа (CC BY-SA 3.0) через Commons Wikimedia

Ex vivo — Ex vivo

Ствол мозга Ex vivo: (A) коронарный вид, отображающий переднюю часть образца ткани, (B) сагиттальный вид отображение левой части образца ткани

Ex vivo (лат. : «из живых») означает то, что происходит вне организма.

Краткое содержание

Play media In situ оценка функции легких и оценка общей емкости легких (TLC) и базальной эластичности после выполнения маневра набора

В науке ex vivo относится к экспериментам или измерениям, проводимым в или на ткани организма во внешней среде с минимальным изменением естественных условий. Условия ex vivo позволяют проводить эксперименты с клетками или тканями организма в более контролируемых условиях, чем это возможно в экспериментах in vivo (в интактном организме), за счет изменения «естественной» среды.

Основным преимуществом использования тканей ex vivo является возможность проводить тесты или измерения, которые в противном случае были бы невозможны или этичны у живых субъектов. Ткани можно удалять разными способами, в том числе частично, как целые органы или как более крупные системы органов.

Примеры использования образцов ex vivo включают:

;
• обнаружение лечение рака агенты, которые эффективны против раковых клеток организма;
• измерения физических, тепловых, электрических, механические, оптические и другие свойства ткани, особенно в различных средах, которые могут не поддерживать жизнь (например, при экстремальных давлениях или температуры );
• реалистичные модели для хирургической процедуры разработки;
• исследования взаимодействия различных типов энергии с тканями; или
• в виде фантомов в визуализация разработка методики.

Термин ex vivo означает, что образцы, подлежащие тестированию, были извлечены из организма. Термин in vitro («внутри стакана») означает образцы для тестирования. ed получены из репозитория. В случае раковых клеток штамм, который дает благоприятные результаты, затем выращивают для получения контрольного образца и количества образцов, необходимых для ряда тестов. Эти два термина не являются синонимами, хотя в обоих случаях тестирование проводится «в рамках стакана». Результаты ex vivo применимы только к организму, поставляющему клетку, тогда как результаты in vitro применимы только к используемой линии клеток.

Ex Vivo vs In Vitro: Understand the Difference

Numerous experimental models currently used in the preclinical arena can aid the research and development of new pharmaceutical compounds and Drug Discovery . These experimental models may range from basic high throughput computational models to more biologically significant animal models but all of them are conceived to better predict the behavior of a particular drug before interacting with the human body.

Attending to the support on which these models are based, they can be classified as:

• In silico
• In vitro
• Ex vivo
• In vivo

All of these expressions are taken from Latin and in this article, we will briefly analyze the differences among them.

In Silico

Silicon plays a central part in conventional information processing, hence the name “in silico” for this computational model. Our current knowledge of information technology has been determinant for the discovery of new molecular entities. The use of modern molecular-modeling tools is helping us to improve drug design strategies to lower toxicity and improve drug stability. These in silico methods are relevant in limiting the broad number of compounds found in the initial phases of pharmacological research known as Drug Discovery and contribute to adding a rationale in the structural design of new drugs.

In Vitro

In vitro is a Latin expression meaning “in glass”. In vitro experiments have been historically conducted in glass test tubes and Petri dishes however, modern laboratory practices mandate the use of single-use plasticware to avoid cross-contamination. These experiments are often performed on cells and sometimes using also bacteria. When the test subjects are cells, they are derived from living organisms and maintained in culture in special conditions that try to mimic physiological circumstances including temperature and sterility. There is a wide variety of cell types which in many cases can be amplified in plastic flasks and distributed in plates with hundreds of small wells for high throughput screening. Some cell types cannot adhere to plastic and are cultured in suspension, forming aggregates. Currently, there is an important shift towards using three-dimensional (3D) cell systems where the higher cell-cell interaction adds another layer of complexity to cellular communication.

Furthermore, advanced in vitro systems such as the organ-on-a-chip technology, offer the next level of complexity introducing microfluidic channels that reproduce blood and/or airflow just as in the human body.

Ex Vivo

The expression “in vitro” appears 18 times more frequently than “ex vivo” in the scientific literature. This is probably why the less common term “ex vivo” might create some confusion. Ex vivo means “outside of a living body” and that implies that tissues are isolated from an animal, taken to the laboratory, and maintained until their use as a research model.

The main difference between in vitro and ex vivo assays is that the former is simply a cell system established in a cell culture laboratory. In contrast, the latter is a tissue not created artificially but directly taken from a living organism. The level of cellular complexity is therefore superior in an ex vivo system and implies a minimal alteration of the organism’s natural conditions.

Some ex vivo assays are simple and just use lymphocytes extracted from whole blood but others involve the use of tissue slices from the liver or the brain which retain the original cytoarchitecture and intercellular connections. The culture and maintenance of these complex tissues are known as organotypic cultures. There are other ex vivo studies where whole organs might be used. This is the case of bovine corneas used for testing ocular corrosives under the eye irritation test OECD 437.

As it can be seen, ex vivo systems represent a model between in vitro and in vivo that can be very resourceful for more specialized studies.

In Vivo

Finally, the use of animal models is the last step in the complexity of biological systems for research. In vivo, assays offer a scenario of a whole organism having inherent biological interactions and with high homology to humans. This is why the use of animal models is highly relevant to predict for example the toxicity of a compound before entering into clinical phases. However, there is a growing ethical concern about the abuse in the use of animals for research and there are policies such as the 3Rs policy that advocate its correct use. The 3Rs stand for Replacement, Reduction, and Refinement of animals meaning that they need to be replaced whenever possible, reduce their number, and minimize the pain, suffering, and distress exercised during the experimental phase.

Overall, there is a need to implement alternatives to animal models that rely on the exploitation of advanced in vitro and ex vivo systems. Moreover, the ideal assay would take advantage of the benefits offered by in vitro testing including the high throughput capacity and economical advantage, and at the same time benefit from the complexity and reliability of an animal model. The Zebrafish is a vertebrate animal model with high genetic homology to humans that gathers all these benefits at once. Zebrafish larvae represent a robust cost-effective animal model with high throughput capacity and no ethical concerns since is not considered an in vivo assay when larvae are under five days postfertilization. Due to all these reasons, Zebrafish are picking up interest and finding their place within the Drug Discovery process.

Лентивирусные векторы: как они стали лучшими векторами для терапии ex vivo

Обзор

Иногда самый безопасный и эффективный вариант генной терапии — не вводить вектор непосредственно пациенту, а наоборот, выделить клетки пациента, произвести с ними генно-инженерные манипуляции и ввести обратно ему же. В таком случае непревзойденный инструмент — лентивирусные векторы. Рисунок в полном размере.

Автор

Редакторы

• CAR-T
• Вирусология
• Генетика
• Генная инженерия
• Генная терапия
• Медицина

Возникшая в конце XX века пандемия ВИЧ-инфекции и сопутствующее распространение синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИДа) послужили толчком к масштабным исследованиям вызывающего эти патологии вируса. В этих исследованиях раскрыли детали организации генома, репликации и жизненного цикла вируса иммунодефицита человека 1, проложив тем самым путь для создания на его основе лентивирусных векторных систем. Такие системы использовались в создании самой первой одобренной CAR-T-терапии — лечения, подарившего надежду безнадежным больным, и ставшего одним из самых громких прорывов в онкогематологии за последние годы. А помогли тут во многом некоторые уникальные свойства лентивирусов, которые, как выяснилось, могут нести не только смерть, но и жизнь.

Генная и клеточная терапии

Спецпроект о генной и клеточной терапиях, тернистом пути их развития, первых успехах и надеждах, а также о сложностях регулирования, производства и изучения этих новейших методов лечения.

Партнер спецпроекта — Департамент разработки генотерапевтических препаратов одной из крупнейших российских биотехнологических компаний — BIOCAD. BIOCAD заслужил серьезные позиции на мировом фармацевтическом рынке благодаря выпуску лекарственных препаратов на основе антител.

Со времени зарождения генной терапии — начиная с самых первых исследований и клинических испытаний — дорога к ее широкому внедрению была тернистой. Впечатляющие успехи чередовались с досадными провалами, отбросившими на новое лечение порочащую тень, что в какой-то момент резко затормозило развитие области [1].

Вы читаете пятую статью спецпроекта «Генная и клеточная терапии». Ранее мы уже информировали вас, как вообще устроены лекарства будущего [2], а также достаточно подробно останавливались на аденоассоциированных вирусах [3] как важном инструменте «генных терапевтов».

К счастью, сегодня все уже не так драматично: генная терапия стала намного безопаснее — регуляторный надзор за ней усилился, а критерии контроля качества стали строже. И все же, бросая даже беглый взгляд на ландшафт современных видов генного лечения, осознаешь, что путь в клинику для большинства таких лекарств до сих пор крайне непрост. Достаточно сравнить число запускаемых клинических исследований с количеством уже вышедших на рынок терапий — последних несоизмеримо меньше. Причин этому немало: это и вопросы безопасности и эффективности; и сложность разработки и масштабирования производства; и вопросы экономической и практической обоснованности внедрения этих совсем недешевых терапий .

Подробнее о тернистом пути разработки и производства генного лечения читайте в статье: «Генные и клеточные лекарства: сложное регулирование для сложных продуктов» [4]; ну а об экономических перипетиях при внедрении сверхдорогих инновационных лекарств (да и не только их) расскажет статья: «Фармакоэкономика: лечить или экономить?» [5].

Однако генная терапия по-прежнему более чем актуальна, ведь она предлагает регулирование молекулярных процессов на новом уровне, тем самым позволяя подбирать ключи к лечению ранее неприступных болезней.

Существующие ныне генные терапии в основном работают по принципу внедрения нужного генетического материала в определенные клетки пациента, что и позволяет модулировать происходящее в организме с лечебными целями. Поэтому для такого лечения критически важна успешная доставка требуемого гена в целевые клетки и ткани, что чаще всего осуществляют с использованием особых носителей — векторов.

In vivo vs Ex vivo

В предыдущих статьях нашего цикла о генной терапии уже были довольно подробно разобраны имеющиеся ныне решения. Не будем сильно повторяться, но отметим особо важные для дальнейшего повествования моменты.

1. Обозревая генную терапию, в основном имеет смысл говорить о доставке генов c применением вирусных векторов, — другие способы пока используют гораздо реже.
2. В рамках такого лечения реализуют два совсем разных подхода: in vivo и ex vivo. Это во многом и определяет выбор подходящих векторов для доставки генов.

Терапия in vivo — это прямой перенос векторов в организм пациента путем внутривенной инфузии раствора, содержащего такие носители. В такой доставке наилучшим образом проявили себя аденоассоциированные векторы, поскольку имеют широкий тропизм — специфичность к различным типам клеток, а также низкий уровень генотоксичности и соответственно бóльшую безопасность [3].

Альтернативно терапевтический ген может быть доставлен ex vivo: для этого клетки сначала отбирают у пациента, генетически модифицируют и культивируют вне организма. И только после этого такие несущие целевые (читай — терапевтические) гены клетки вводят путем инфузии обратно пациенту (рис. 1) [6].

Рисунок 1. In vivo vs Ex vivo. Терапия in vivo заключается в прямой доставке в организм пациента векторов, содержащих терапевтические гены. В отличие от этого, подход ex vivo включает предварительный отбор клеток у пациента, их генетическую модификацию in vitro (это, как правило, внедрение нужного — лечебного — гена), затем отбор эффективно трансдуцированных клеток с последующим размножением и введением такой культуры клеток обратно пациенту.

Для клинических приложений терапии ex vivo изначально были особо интересны γ-ретровирусы и лентивирусы, — ведь они способны перманентно интегрировать свой генетический материал в геном клеток организма-хозяина, что подразумевает передачу генов интереса при делении в ряду клеточных поколений, а значит, низкую элиминацию и долгоиграющую экспрессию.

Однако по сравнению с γ-ретровирусными векторами лентивирусы оказались безопаснее в доклинических исследованиях, а потому сейчас преимущественно используются именно они [7]. Лентивирусные векторы способны еще и трансдуцировать как постмитотические, так и неделящиеся клетки, в то время как для эффективного инфицирования с использованием других ретровирусных платформ требуется, чтобы клетка активно делилась [6]. Дело в том, что среди всех ретровирусов только лентивирусы способны проникать через ядерную мембрану.

Серьезными плюсами лентивирусных векторов являются также относительно низкая стоимость и возможность масштабирования производства. Эта платформа была выбрана для создания одной из наиболее многообещающих ныне генных терапий ex vivo: онколечения с использованием CAR-T-клеток [8], — и используется сегодня при разработке таких препаратов наряду с γ-ретровирусами. К этому мы еще вернемся.

Лентивирусы в природе: что они собой представляют?

Строение

Род лентивирусов из семейства ретровирусов отличается наличием особой оболочки (суперкапсида), внутри которой заключен геном в виде положительной одноцепочечной РНК , которая после попадания вируса в клетку конвертируется в двухцепочечную ДНК. Наиболее известный их представитель — вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) [9]. Покрывающий такие вирусы суперкапсид — сферический, слегка плеоморфный, диаметром приблизительно 80–100 нанометров. Длина его генома около 9 килобаз (тысяч пар нуклеотидных оснований), включая три основных структурных гена: gag, pol и env (рис. 2).

Под положительной (+) РНК понимают геномную нуклеиновую кислоту вируса, похожую на мРНК, благодаря чему информация в ходе трансляции — синтеза полипептидной цепи вирусного белка в зараженной клетке — может считываться непосредственно с нее. Такую (+)РНК называют также смысловой. В отличие от этого, антисмысловая (−) РНК комплементарна мРНК, и для перевода в аминокислотную цепочку ее требуется сначала реплицировать в (+)-форму с помощью фермента РНК-репликазы.

Рисунок 2. Лентивирус: геномная карта и структура вириона. Важный для проникновения в клетку ген env обозначен зеленым цветом.

Ген gag первым транскрибируется в незрелую пре-мРНК, которая затем расщепляется на отдельные транскрипты, кодирующие три белка вирусного кора:

1. Матричный белок (matrix, MA) необходим для сборки вириона и инфекции неделящихся клеток.
2. Капсидный белок (capsid, CA) формирует гидрофобную «сердцевину» вириона.
3. Нуклеокапсидный белок (nucleocapsid, NC) накрепко связан с РНК в вирионе — он механически «укрывает» последовательность нуклеотидов, защищая тем самым вирусный геном.

Ген pol кодирует ферменты, необходимые для репликации генетического материала: вирусную протеазу (PRO), обратную транскриптазу (RT) и интегразу (IN).

Наконец, ген env кодирует белок вирусной поверхности: гликопротеин gp160, который в процессе созревания вирусной частицы расщепляется на белок поверхности вириона gp120 (SU) и трансмембранный белок gp41 (TM).

Кроме того, вирусный геном содержит регуляторные гены (tat и rev), которые после инфицирования вирионом экспрессируются первыми и нужны для ускорения продукции мРНК, а также четыре вспомогательных гена (vif, vpr, vpu, и nef) [10].

Жизненный цикл лентивирусов

Жизненный цикл лентивируса можно немного обобщить и представить в виде шести основных шагов (рис. 3).

На первой стадии вирион связывается со своей клеткой-мишенью через взаимодействие между белком вирусной оболочки gp120 (SU) и особым рецептором клеточной поверхности.

Существование этих поверхностных и специфичных белков-рецепторов собственно и определяет особую способность вирусов инфицировать строго определенные типы клеток (известную также как тропизм).

Рисунок 3. Жизненный цикл лентивируса. 1. Связь с клеточной поверхностью и проникновение в клетку. 2. Высвобождение содержимого вириона во внутриклеточную среду. 3. Обратная транскрипция. 4. Интеграция в геном. 5. Биосинтез вирусных белков и сборка вирионов. 6. Выход вирусных частиц из клетки.

При инициации цикла заражения вирусом ВИЧ, помимо взаимодействия гликопротеина SU с первичным рецептором СD4 на поверхности лимфоцитов Т-хелперов (что и определяет патогенез ВИЧ-инфекции), происходит также его связывание с корецепторами: CXCR4 или CCR5.

Затем вирусные трансмембранные белки (TM) изменяют свою конформацию, чтобы сблизить вирион и клетку, что приводит к слиянию их мембран и проникновению вируса в клетку (этап 1 на рисунке 3).

После входа в клетку матрикс вируса — то есть все его содержимое, кроме слившегося с мембраной клетки суперкапсида, — распределяется в цитоплазме на составляющие элементы: структурные белки капсида, нуклеиновые кислоты вирусного генома, а также ферменты, необходимые для успешной репродукции генетического материала (этап 2 на рисунке 3).

Используя вирусную РНК как шаблон, а также нуклеотиды зараженной клетки, обратная транскриптаза начинает синтезировать комплементарную вирусную ДНК, а точнее — провирусную ДНК (этап 3 на рисунке 3); последняя затем импортируется в клеточное ядро, вставляясь там с использованием вирусной интегразы в геном клетки-мишени (этап 4).

Дальнейшая репродукция генетического материала идет уже как по нотам: в соответствии с центральной догмой молекулярной биологии. Из последовательности провируса в геноме транскрибируются одноцепочечные (+)РНК, затем с них транслируются вирусные белки (этап 5); они упаковывают вирусные нуклеиновые кислоты так, чтобы в одном вирионе таких последовательностей было две (этап 5).

После этого сформированные вирусные частицы, прорывая цитоплазматическую мембрану, выходят из клетки, формируя из ее фрагментов свой суперкапсид (этап 6 на рисунке 3). Ну а такие новые вирионы заражают уже другие клетки, и весь описанный цикл повторяется [10].

Создание лентивирусных векторов

Теперь мы знаем, как структурно устроены лентивирусы, каков их жизненный цикл, но пока еще не разобрались, что собой представляют лентивирусные векторные системы, — как они работают и как их производят. Что же, рассмотрим и этот вопрос.

Безопасность превыше всего

Рекомбинация

Лентивирусы имеют высокую частоту рекомбинации (обмена частями генома между двумя вирусами) и быстро мутируют. Отсюда естественные опасения, что векторы на их основе смогут самопроизвольно воспроизводиться в организме человека и благодаря дальнейшей «перетасовке генов» приводить к появлению суперинфекций. Чтобы снизить подобные риски при разработке векторных систем, основные гены исходных вирусов стали распределять в отдельные плазмиды. При этом полученные векторы (уже неспособные к репликации) — далее еще и последовательно улучшали: на сегодняшний день сменилось уже три поколения таких частиц.

Инсерционный мутагенез

Помимо образования репликационно компетентного вируса, вторым основным риском при применении ретровирусных векторов является онкогенез, возникающий за счет так называемого инсерционного мутагенеза. Критически важно оценивать такие риски, ведь γ-ретровирусы имеют тенденцию встраиваться вблизи генных регуляторных последовательностей, что представляет большую опасность. В частности, в клинических исследованиях с использованием таких частиц фиксировались случаи смерти от развившегося лейкоза [11].

Именно поэтому в поле генной терапии наблюдается постепенное смещение в пользу преимущественного использования лентивирусных векторов, которые намного безопаснее [12]. Они предпочитают транскрипционно активные регионы, но интегрируются в основном в «тело гена» (преимущественно в интроны), избегая энхансеров и промоторов, — что и снижает (и довольно существенно) риски онкогенеза [11], [12].

Поскольку инсерция в транскрипционно активные регионы все же может быть генотоксичной, для усиления биобезопасности разработали так называемые самоинактивирующиеся векторы (self-inactivating, SIN). Они обладают делецией в регионе 3′-LTR вирусного генома: во время обратной транскрипции эта делеция переносится на 5′-LTR провирусной ДНК, что подавляет транскрипционную активность.

Это предотвращает продукцию полноразмерного вируса (после интеграции векторного генома в геном клетки-хозяина), минимизируя тем самым вероятность возникновения репликационно активных вирусных частиц [13]. Более того, такая делеция снижает вероятность, что клеточные кодирующие последовательности, в которые встроился вектор, будут аберрантно экспрессироваться в связи с активностью промотора или через энхансерный эффект. Наконец, дизайн SIN предотвращает потенциальную транскрипционную интерференцию между LTR и промотором, управляющим экспрессией трансгена [13].

Другая повышающая безопасность модификация заключается во включении синтетического инсулятора хроматина в лентивирусные векторы, что снижает взаимодействия между трансгеном и ближайшими к нему генами, также уменьшая возможность аберрантной экспрессии.

Кроме того, правильный подход к дозированию векторов позволяет избегать множественных интеграционных событий в клетке. В идеале требуется подобрать такую дозу, чтобы интеграция происходила в среднем один раз на клетку [12].

В совокупности, все перечисленные меры снижают риск генотоксичности, однако говорить о том, что он сведен на нет, пока еще рано. В нескольких последних исследованиях с использованием лентивирусных векторов были зафиксированы случаи возникновения онкологических заболеваний. В двух из них после проведения расследования испытания продолжили, так как вероятность связи генной терапии и онкозаболеваний посчитали пренебрежимо малой.

Для одного из случаев вопрос о взаимосвязи использования лентивирусных векторов и онкозаболеваний пока остается открытым. Наверное, и мы не будем делать поспешных выводов, ведь с одной стороны, — опасность инсерционного онкогенеза при использовании лентивирусов вполне реальна, а с другой — серьезной статистики по таким случаям нет. Кроме того, в случае очень тяжелых заболеваний, где альтернатива для пациента — постепенное ухудшение состояния и гарантированная смерть через несколько лет, небольшой риск может быть оправдан. Разумеется, ученые при этом не прекращают искать более безопасные способы модификации геномов.

Три поколения векторов

Первые лентивирусные векторные системы содержали три плазмиды: трансферную (transfer), оболочечную (envelope), и упаковочную (packaging).

Упаковочная плазмида содержала бóльшую часть генома исходного вируса: структурные, ферментативные, регуляторные и вспомогательные последовательности, — и не включала гены, кодирующие поверхностные белки вириона. А ведь именно они нужны для связи с клеткой и проникновения в нее, что является ключевым этапом репликативного цикла. Поэтому такие векторные системы (с удаленным геном env) — к репликации уже неспособны, однако уметь проникать в клетку они ведь все же должны — иначе как же они доставят туда целевые гены?

За это отвечает оболочечная плазмида, несущая последовательность вирусного гликопротеина (такого как оболочечный гликопротеин G вируса везикулярного стоматита VSV-G) для помощи векторной частице в связывании с рецепторным белком на поверхности клетки.

Эта технология, основанная на общем свойстве большинства ретровирусов, — возможности формировать так называемые псевдотипы (частицы, в оболочку которых включается поверхностный белок какого-то другого вируса) — позволила расширить диапазон поражаемых ими клеток. Псевдотипированные белком VSV-G векторы обладают уникальными преимуществами: большей стабильностью, а также способностью связываться с рецепторами LDL (липопротеинов низкой плотности), присутствующим на поверхности множества клеток, — что и определяет широкий тропизм этих частиц [10]. Существуют и другие варианты псеводтипирования векторов, расширяющие их тропизм (табл. 1).

Таблица 1. Различные псевдотипы лентивирусных векторов, гликопротеины их вирусных оболочек, и свойственный таким псевдотипам клеточный тропизм.Источник: [14].

Лентивирусные псевдотипы	Исходный вирус (у которого «позаимствован» поверхностный гликопротеин вирусной оболочки)	Клеточный рецептор, с которым связывается псевдотип	Клеточный тропизм	Эффективность
VSV-G	Вирус везикулярного стоматита	LDL-R	Широкий тропизм в не первичных (подвергнутых хотя бы одному пассивированию) культурах клеток	Высокая
BaEV	Эндогенный ретровирус павиана	ASCT-1 ASCT-2	CD34+ клетки	30%
			Наивные Т-клетки	До 80%
			Наивные В-клетки	40%
			В-клетки памяти	20%
			Натуральные киллеры	40%
			Ранние тимоциты	До 80%
RD114	Эндогенный ретровирус кошек	ASCT-2	Наивные Т-клетки	До 60%
			Наивные В-клетки	До 30%
H/F	Вирус кори	SLAM CD46	CD34+ клетки	──
			Покоящиеся Т-клетки памяти	──
			Наивные Т-клетки	До 50%
			Покоящиеся В-клетки
			Покоящиеся гемопоэтические стволовые клетки	До 70%
			Дендритные клетки
G/F	Вирус Нипах	EphinB2/B3	Перициты	20–40%
			Клетки эндотелия опухоли
COCV	Везиколовирус Кокал	LDL-R	Стимулированные клетки CD34+	До 80%

Наконец, последний компонент векторной системы первого поколения — трансферная плазмида — несет целевой трансген, а также так называемую последовательность пси-петли (ψ-петли), — и все это в обрамлении длинных терминальных повторов (long terminal repeats, LTRs). Последние два элемента необходимы для упаковки вирусной РНК в вирион (рис. 4).

Рисунок 4. Упаковка лентивирусных векторов в клетке (на примере третьего поколения таких систем).

После заражения клеток тремя вышеназванными плазмидами в них происходит сборка вирусных частиц, а затем уже их выход наружу. Высвобождаемые векторы содержат VSV-G (он помогает им впоследствии проникать в клетки), но внутри них нет гена, кодирующего этот белок. Так происходит потому, что в кодирующей VSV-G плазмиде отсутствуют генетические последовательности, необходимые для сборки белковой вирусной оболочки, а значит, все ее содержимое запаковаться в вирион уже не сможет.

Поэтому такие частицы умеют доставлять гены в клетку, но не способны размножаться. Чтобы они вдруг снова научились этому, необходима рекомбинация между нашими векторами и, например, природными лентивирусами. Гипотетически это возможно, хоть и маловероятно, — ведь для восстановления репликативно компетентного генома должно многое совпасть: одновременное заражение клеток и вектором, и вирусом, а также прицельный обмен между ними генетическим материалом, — что в силу случайного характера рекомбинации вряд ли случится.

Тем не менее чтобы обезопаситься еще больше, исследователи стали менять исходный геном лентивируса еще сильнее: разбивать его на большее число плазмид, удалять еще больше нецелевых генов, а также модифицировать все необходимые в векторе нативные последовательности. Такие стратегии легли в основу создания лентивирусных векторов второго и третьего поколений (табл. 2).

Таблица 2. Второе и третье поколения лентивирусных векторов.Источник: Merck.

Характеристика	Второе поколение	Третье поколение
Количество плазмид	3	4
Наличие делеции в области U3 в 3′ LTR — для создания самоинактивирующегося вектора (Self-INactivation, SIN)	Нет	Да
5′ LTR	Дикого типа (5′ LTR)	Химерные (RSV)
Количество упаковочных плазмид	1	2
Вспомогательные гены: vif, vpr, vpu, nef	Отсутствуют	Отсутствуют
tat и rev гены	В упаковочной плазмиде	Ген tat удален, rev в отдельной упаковочной плазмиде
gag и pol гены	В упаковочной плазмиде, вместе с tat и rev	Вместе в отдельной плазмиде
Псевдотипирование	Псевдотипированы (VSV-G)	Псевдотипированы (VSV-G)
Количество рекомбинационных событий, необходимых для генерации репликационно компетентных вирусов	3 рекомбинации	4 рекомбинации

Производство

Создание эффективных векторных систем — это лишь первый этап к достаточной продукции нужного материала. Не менее важна разработка технологии производства и ее последующее масштабирование на большие объемы, — чтобы можно было получать требуемые частицы в нужных количествах. При этом в современном мире продукция вирусных частиц для лечебного применения должна идти по Правилам надлежащей производственной практики (известной также как GMP). На рисунке 5 даны основные стадии производства лентивирусных векторов.

Рисунок 5. Основные этапы продукции вирусных векторов на современном производстве, работающем в соответствии с принципами GMP. Все начинается с культуры специальных «клеток-упаковщиков» (таких как HEK293T или PG13). Эти особые упаковочные линии культивируют в течение нескольких дней, заражают плазмидами третьего поколения лентивирусного вектора, и затем уже такие вектор-продуцирующие клетки снова размножают в культуре. После этого векторы выделяют и очищают от остатков клеток (т.н. дебриса: различных клеточных органелл, плазмалеммы и т.д.), а также других загрязняющих примесей. После очистки содержащий векторы полупродукт фильтруют через мембрану с определенным размером пор, не пропускающюю микроорганизмы (что позволяет достичь стерильности). Далее полученный сток асептично распределяют по отдельным аликвотам и криоконсервируют. Сообщалось, что такие замороженные при −80 °С векторы могут сохранять свою стабильность до 9 лет после криоконсервации. Стоит также отметить, что в течение всего описанного процесса очень важен контроль качества, ведь, например, не до конца удаленный из стоков вектора клеточный дебрис может вызывать воспалительные реакции, что было показано в исследованиях как in vitro, так и in vivo [15].

Альтернатива: стабильные упаковщики

Еще один способ получать лентивирусные векторы, помимо временной трансфекции плазмидами, — создание стабильных линий клеток-упаковщиков. Для этого геном клеток (чаще всего это клетки почки человеческого эмбриона HEK293T) модифицируют так, чтобы они смогли стабильно экспрессировать бóльшую часть вирусного генетического материала.

Такие клетки-упаковщики, как правило, экспрессируют гены gag, pol и rev, а зачастую также ген капсида VSV-G. Далее для использования в качестве продуцентов векторов их нужно заразить плазмидой, несущей целевой ген.

Пока что такие стабильные линии используют реже чем «стандартные» клетки-продуценты, ─ но перспективы расширения их применения весьма заманчивы. Они могут осуществлять долгоиграющую экспрессию, что крайне желательно, ─ так как позволит упростить производство, снизив тем самым и его стоимость [16].

Применение лентивирусных векторов в клинике

С момента первых применений лентивирусные векторы стали одним из основных инструментов арсенала генной и клеточной терапии с заметными успехами в клинических исследованиях [17]. Одна из причин — они изначально обладали большим потенциалом благодаря способности эффективно трансдуцировать CD34 + стволовые клетки. Из последних, как известно, в процессе гемопоэза появляются все остальные типы кровяных клеток [18], а потому их генетическая модификация была крайне привлекательна. Ведь после дифференциации эти измененные клетки теоретически смогут остановить (или хотя бы притормозить) патогенез самых разных связанных с ними болезней.

Ученым и медикам оставалось лишь проверить эту теорию практикой, и вскоре перенос генов с использованием лентивирусного вектора в CD34+ стволовые клетки был осуществлен для лечения нескольких генетических заболеваний. Среди них: бета-талассемия, серповидноклеточная анемия, Х-сцепленная адренолейкодистрофия, метахроматическая лейкодистрофия, синдром Вискотта—Олдрича и др. При этом о наличии каких-либо связанных с вектором серьезных нежелательных явлениях в этих исследованиях заявлено не было (о первом тревожном сигнале, связанным с онкогенезом, рассказано выше) [15].

Ранние успехи подстегнули развитие такого лечения, и, согласно регистру клинических испытаний ClinicalTrials.gov, функциональность лентивирусного вектора сейчас уже тестируют более чем в 4000 исследований. При этом известно, что и количество подобных испытаний непрерывно и экспоненциально растет, например: в 2017 г. их было около 200, в 2020-м — более 600 [19], ну а сегодня, как видим, — уже на порядок больше. Из такого обширного поля настоящими прорывами можно назвать уже одобренное лечение, — а это пока что два генных продукта:

1. Zynteglo (Bluebird bio, Массачусетс, США) для лечения бета-талассемии.
2. Kymriah (Novartis, Базель, Швейцария) для лечения онкогематологических болезней [19].

Они оба представляют собой лечение ex vivo аутологичными генномодифицированными клетками крови пациентов, однако Novartis использует еще и принципиально новый (хоть и разрабатываемый немало лет) подход — внедрение генов для изменения поверхностного рецептора T-лимфоцитов. После модификации такой рецептор способен распознавать специфичные маркеры на опухолевых клетках, — ну а уже измененные T-клетки пациентов уничтожают злокачественные бласты .

Заключение и перспективы

Одно из направлений улучшения генной терапии — разработка новых векторов-носителей. В частности, представляют интерес не интегрирующиеся лентивирусные векторы (non-integrating lentiviral vectors, NILVs) — они привлекательны в плане снижения вероятности инсерционного мутагенеза. В них выключен фермент вирусная интеграза (как мы помним, отвечающая за внедрение провирусной последовательности в геном клетки) — и они точно так же умеют инфицировать как делящиеся, так и неделящиеся клетки. При этом вирусный геном остается в клетке в виде эписомы, а не интегрируется в геномную ДНК [15].

NILVs стабильно экспрессируют трансгены из эписомальной ДНК в неделящихся клетках, и временно — если клетки-мишени размножаются. Было показано, что такие векторы имеют широкий тропизм ко множеству различных типов клеток и тканей, что вкупе с повышенной безопасностью делает их идеальными кандидатами для использования в вакцинации и иммунотерапии.

Это также открывает перспективы использования NILVs как инструмента для доставки компонентов CRISPR/Cas9 — революционной технологии, которая ныне широко используется в исследованиях генного редактирования. Она включает так называемую направляющую РНК, помогающую распознавать нужные участки генома в клетке для связи с ними нуклеазы Cas9. Последняя начинает в этом месте расщеплять спираль ДНК, создавая двухцепочечные разрывы, которые затем могут быть репарированы определенным образом — с удалением (делецией) каких-либо «поломанных» генов, или внедрением в этом месте каких-то новых кодирующих последовательностей.

Сегодня существуют лентивирусные системы, умеющие доставлять в клетку как направляющие РНК, так и нуклеазу Cas9 (точнее кодирующие их последовательности — для последующей экспрессии).

Лентивирусные векторы также часто используют в исследовательских целях для изменения экспрессии генов посредством использования короткой шпилечной РНК или антисмысловой РНК [23], — что является частью уже известного механизма РНК-интерференции (об этом интересном феномене «Биомолекула» писала уже не раз).

Конечно, пока что большинство из таких перспективных подходов все еще находится на ранних стадиях разработки, и необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить, насколько лентивирусные векторы по настоящему «жизнеспособны» — как инструмент для терапевтической доставки компонентов редактирования/регуляции экспрессии тех или иных генов [15].